キサントモナス感染とオゾンストレスは、トウガラシの葉状領域における微生物群集構造と相互作用に明確な影響を与える

May 03, 2023

ISME Communications volume 3、記事番号: 24 (2023) この記事を引用

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生物的および非生物的ストレスに対する宿主の生理学的応答および転写応答は熱心に研究されているが、関連するマイクロバイオームの回復力と、これらのストレスに対する耐性または応答に対するそれらの寄与についてはほとんど知られていない。 私たちは、対流圏オゾン（O3）の上昇が、抵抗性および感受性のあるトウガラシ品種の全体的な病気の転帰と、それらに関連するマイクロバイオームの構造、機能、および相互作用ネットワークに及ぼす、オープントップチャンバーフィールド条件下で、個別におよびXanthomonas perforans感染と組み合わせて、上昇した対流圏オゾン（O3）の影響を評価しました。成長期を通して。 病原体感染により、感受性品種では異なる微生物群集の構造と機能が生じましたが、同時に発生した O3 ストレスは群集の構造と機能をさらに変化させませんでした。 しかし、O3 ストレスは抵抗性品種の病気の重症度を悪化させました。 この疾患の重症度の変化は、関連するザントモナス属の個体数における不均一性の増大を伴ったが、全体的な微生物叢の密度、微生物群集の構造、および機能には明らかな変化は見られなかった。 O3 ストレスと病原体攻撃を同時に受けた微生物の共起ネットワークは、最も影響力のある分類群の変化とつながりの少ないネットワークを示しており、これはコミュニティのメンバー間の相互作用の安定性の変化を反映している可能性があります。 耐性品種での病気の重症度の増加は、このような微生物共起ネットワークの変化によって説明される可能性があり、O3 上昇下での病原体に対するマイクロバイオーム関連の予防シールドの変化を示しています。 私たちの発見は、微生物群集が個別および同時のストレス要因、この場合はO3ストレスと病原体感染に明確に反応し、気候変動に直面して植物と病原体の相互作用がどのように変化するかを予測する上で重要な役割を果たす可能性があることを示しています。

植物の葉圏 (地上部分) は、栄養に乏しい独特の生息地であり、葉の表面 (着生植物) または葉の組織の内部 (内部寄生植物) に定着するさまざまな原核生物および真核生物 [1] の微生物が生息しています [2、3] 。 葉の微生物群集の集合と継承は、決定論的および確率的プロセスの影響を受けます。 近隣の植物からの分散や、近隣のアイデンティティや年齢などの他の人口統計的要因が葉圏マイクロバイオームの多様性に寄与する要因であるが [4]、宿主の遺伝子型、発育段階 [5]、宿主抵抗性 [6] などの植物宿主要因がマイクロバイオームの集合体を形成する。 このマイクロバイオームの宿主によるフィルタリングは、葉の表面で利用可能なリソースの違い [7]、物理的特性の違い [8]、および宿主防御シグナル伝達 [9、10] によって観察されます。

葉圏マイクロバイオームのメンバーは、栄養素の獲得 [11]、植物の成長と生産性 [12]、さまざまな生物的および非生物的ストレスに対する耐性 [13、14、15、16、17] において役割を果たすことが知られています。 病原体の侵入は、葉圏における植物微生物の集合に影響を与える最も影響力のある生物ストレスの 1 つです [18]。 病原体は病原性因子、生物界面活性剤、またはホルモンの分泌によって生息地を改変することができ、それによって日和見主義者を含む他の居住者入植者が繁栄するための資源の利用可能性を増加させる[19、20]。 病原体は、ニッチまたは資源の競争を通じて常在微生物相に影響を与えることもあります [1、18、19、21]。 病原体の攻撃に応答して活性化される植物防御シグナル伝達も、葉圏群集の変化の原因として示されている[16、22]。 葉圏群集への変化の原因に関係なく、支配的なメンバーがこの混乱した群集の安定性を回復すると考えられています [23]。 さらに、植物が病原体に対する防御を提供する葉圏の微生物を補充できることを示唆する証拠が増えており[24、25、26]、これは根圏で観察されたものと同様に、病原体に反応して葉圏で病気を抑制するマイクロバイオームの集合が示されていることを示している[24,25,26]。 27、28]。 葉圏の微生物群集の構造と組成は、干ばつ [29, 30]、表面温度の上昇または温暖化 [31,32,33]、二酸化炭素の上昇 [34]、紫外線 [34] などの非生物的ストレスに対する宿主植物の応答によっても形成されます。 35]。

非生物的ストレス因子は、防御ホルモンシグナル伝達を妨害することによって病原体に対する宿主の感受性を変化させる可能性があり[36]、その結果、疾患の発生率に影響を与える可能性がある。 植物が生物的および非生物的なストレス因子に同時に曝露されると、異なる防御シグナル伝達経路が相互作用または阻害し合う可能性があるため、各ストレスのタイミング、性質、重症度に応じて植物の反応にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります[37、38]。 さらに、最近の研究では、気候変動が病原体の地理的範囲外への拡散により病気の発生率の増加につながる可能性があることを実証している[39]。 まとめると、葉圏マイクロバイオームを形成する可能性のある内部および外部要因は数多くあり、生物的および非生物的ストレス因子の同時発生に対する植物の応答において葉圏マイクロバイオームが果たす役割を完全に理解するには研究が必要です。

植物が経験する非生物的ストレス要因の 1 つは、対流圏オゾン (O3) レベルの上昇です。 温室効果ガスによって引き起こされる地球温暖化は、窒素酸化物 (NOx)、CO、メタン、その他の揮発性有機化合物などの前駆物質の増加により、対流圏 O3 の増加をもたらしました [40、41]。 米国全土の研究では、毎日 8 時間の最大 O3 の 5 ～ 95 パーセンタイルが 2012 年の 31 ～ 79 ppb から 2050 年には 30 ～ 87 ppb に増加すると予測されています [42]。 40 ppb を超える O3 濃度は植物毒性が非常に高いため、この O3 レベルの増加は重要です [43]。 O3 の上昇は、目に見える傷害や光合成の低下など、植物や多くのレベルに悪影響を与える可能性があり、その結果、植物の成長、栄養価、作物の収量、炭素配分の変化に影響を及ぼします [43、44、45]。 気候変動に関連する非生物的および生物的ストレッサーが分子、細胞、またはトランスクリプトームレベルで植物の反応にどのような影響を与えるかについてさらに学ぶにつれて、対処すべき重要な疑問は、個別のまたは同時のストレッサーの存在下で、関連するマイクロバイオームが植物の反応にどのように反応するか、または植物の反応に寄与するかということです。葉圏微生物群集の重要な生態学的機能がストレス因子の存在下で変化するかどうか。

これらの疑問に対処するために、我々は、周囲の高いO3レベルの存在下で、葉の病原体であるXanthomonas perforansに対する耐性が異なる2つのコショウ品種の葉圏マイクロバイオームの応答に明確に焦点を当てました。 私たちは、オープントップチャンバー（OTC）を含む野外実験装置を使用して、O3レベルを操作し、植物病害の全体的な結果およびマイクロバイオーム構造に対する遺伝子型×環境（G×E）の相互作用の影響を分析することができました。そして機能。 この研究で使用された 2 つのトウガラシ品種は、米国南東部で新たに出現したトウガラシ病原体である X.perforans に対する耐性が異なりました。1 つは感受性のある品種 Early Cal Wonder で、もう 1 つは商用品種 PS 09979325 で、主に米国南東部で展開され、知られています。細菌性斑点病原体の11種族すべてに対して多遺伝子性の定量的耐性を有すること[46]。 この特定の宿主病理系により、複合ストレス要因下での耐性品種の反応を研究し、それによって気候条件の変化下での耐久性を評価できるだけでなく、新興トウガラシ病原種である X. perforans の反応をテストすることも可能になった [47] 、変化した環境下での感受性品種と商業耐性品種について。 私たちは、葉圏の微生物群集は、品種に関係なく、O3レベルの変化に応じて分類学的および機能的プロファイルの両方に変化を示し、季節動態にも変化を示すだろうと仮説を立てました。 興味深いことに、植物の感受性に対する O3 の上昇の影響は、病原体のライフスタイルに依存します。 このような異なる効果は、生理学的差異、病原体生物学、または防御シグナル伝達経路の差異に起因する可能性がある[48、49、50]。 私たちは、O3 の上昇により、たとえ耐性品種であっても、コショウのバクテリアスポットキサントモナドに対する全体的な感受性が高まるのではないかと仮説を立てました。 また、病気の発生により葉圏マイクロバイオームの季節動態が混乱し、この影響は高い病気圧力を支える環境ではより強くなるだろうという仮説も立てました。 私たちの実験デザインにより、病原体に対する抵抗性が異なる品種の全体的な病気の転帰に対する酸素濃度の上昇の影響に対処することができ、また、同時ストレス要因下での葉圏マイクロバイオームの分類学的および機能的プロファイルの評価も容易になりました。 最後に、研究では群集の構造と集合において種ではなく機能の重要性が示されているため[51]、我々はマイクロバイオームの機能プロファイルを比較して、生物的または非生物的なストレス因子に関係なく群集の生態学的機能がむしろ保存されているかどうかを確認した。

実験は、2021年の成長期（5月から7月）にオーバーン大学の大気堆積（AtDep）サイト（図S1A）で実施され、O3ストレスの影響をテストできるOTC（図S1B）を活用しました。植物 - 病原体 - マイクロバイオームの相互作用について研究し、植物の防御と発達のトレードオフの複雑さに対処します。 燻蒸には 12 個のチャンバーを使用しました。そのうち 6 個のチャンバーは周囲環境であり、6 個のチャンバーは O3 が上昇していました (図 S1A)。 各高架 O3 チャンバーには 4 つの O3 発生器 (HVAC-1100 オゾン発生器、Ozone Technologies、ハル、アイオワ州、米国) が含まれており、2 つの紫外線電球 (モデル GPH380T5VH/HO/4 P、Ozone Technologies、ハル、アイオワ州、米国) を備えています。 O3。 発電機と電球は、高架の O3 チャンバー ファン ボックス内にあります。 O3 の望ましい設定値 (約 100 ppb) に到達するために、O3 発生器は 0 ～ 10 V の制御線によって制御され、アナログ出力モジュールを介して制御されました。 植物を燻蒸するために、オゾン化空気がファンボックスからオープントップチャンバーのプラスチックライニングに吹き込まれました（図S1B）。 チャンバー下部のプラスチックパネルは二重壁になっており、内側のパネルに穴があり、チャンバー内の植物にO3が放出されます。 各チャンバーはプラスチックチューブを介して中央のガスマニホールドに接続されており、各チャンバーは 3 方ソレノイドバルブによって順次開かれます。 マイクロコントローラーは 24 分ごとに 12 個のソレノイド バルブを循環し (12 個のチャンバーのそれぞれを 2 分間サンプリング)、燻蒸ウィンドウ中に各チャンバー (モデル 205 デュアル ビーム オゾン モニター、2B Technologies、コロラド州ボルダー、米国) からの O3 を監視します (午前10時から午後6時まで）。 この実験中、対照チャンバーの平均[O3]は約30.6 ppbでしたが、燻蒸チャンバーの平均[O3]は約90.3 ppbでした（図S1C）。 高架チャンバー内の O3 レベルは、周囲チャンバーと比較して成長期に有意に高かった (Kruskal-Wallis、p = 0.04) 一方で、高架チャンバー間の O3 レベルは同様でした (p = 0.62)。

接種は、両方の品種の生後5〜6週目の苗木に行われました。 0.0045% (vol/vol) Silwet L-77 (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS, USA) で修正した MgSO4 緩衝液中で 106 CFU/ml に調整した X.perforans 懸濁液を植物に接種しました。 対照植物を、0.0045% (vol/vol) Silwet L-77で修正したMgSO4緩衝液に浸漬接種した(図S1D)。 ディップ接種した植物を、無土壌鉢植え培地（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈ Ｈｏｒｔｉｃｕｌａｔｕｒｅ、ＰＡ）を用いて滅菌１０インチプラスチックポット（Ｔｈｅ ＨＣ Ｃｏｍｐａｎｙｓ、オハイオ州）に移植した。 次いで、ポットを上記のＯＴＣに移し、収穫までの成長期を通してＯＴＣ内に維持した。 各チャンバーには、Early Cal Wonder（以下、感受性品種と呼びます）とPS 09979325（以下、耐性品種と呼びます）のそれぞれ6本の植物がありました（図S1E）。 12のチャンバーのうち、6つのチャンバー（3つの周囲環境と3つの高O3）の植物に病原体X.perforansが接種されましたが、6つのチャンバー（3つの周囲環境と3つの高O3）にはMgSO4バッファーが接種された対照植物がありました（図S1A）。

全体的な病気の発症は、ホースフォール・バラット評価 [52] をシーズンの中盤と終わりの両方で評価範囲の中間点に変換した後、細菌性斑点によって引き起こされる病気の症状の割合を推定することによって評価されました [53]。

ペッパーの葉サンプルは、キサントモナスまたは MgSO4 緩衝液での接種後、チャンバー内に植物を保管する前 (ベース サンプル) に続いて、生育期の他の 2 つの時点 (栽培期間の半ばと終わり) に続く前に、各品種の接種サンプルと対照サンプルの両方から別々に収集されました。季節）。 各時点で、1 つのチャンバー内で栽培された各品種の 6 つの植物の葉がプールされたため、品種ごとに 1 つのサンプルが得られます。 サンプリング中、病気の葉への偏りを避けるために、各品種の植物あたり少なくとも 1 枚の葉を含む葉をランダムに収集しました。 葉サンプル 40 グラムを、0.02% Tween 20 で修正したリン酸緩衝食塩水 (50 mM) 中で 15 分間超音波処理し、取り除かれた細胞をペレット化し、DNA 抽出のために処理しました。 簡単に説明すると、製造元の指示に従って、Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega、ウィスコンシン州マディソン) を使用し、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1) を添加し、続いてエタノール沈殿を行い、全 DNA を抽出しました。 DNA は Qubit 3.0 蛍光光度計 (Thermo Fischer、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して定量され、DNA サンプルはライブラリー調製およびペアエンドのためにデュークゲノムおよび計算生物学センター (デューク大学、ノースカロライナ州ダーラム) に提出されました。リード (2 × 150 bp) は NovaSeq 6000 S1 フローセル システムでシーケンスされました。 次に、BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/) を使用して生の読み取りを品質のためにトリミングし、続いて KneadData (https://bitbucket.org/biobakery/) を使用してホストの汚染を除去しました。 kneaddata/) ペッパー cv を使用。 59 (GCA_021292125.1) ゲノムを参照として使用します。

品質管理され宿主除染されたリードは、古細菌、細菌、ヒト、およびウイルス配列の RefSeq ライブラリ [55] を含む標準的な Kraken2 データベースに対して、Kraken2 (v2.1.2) [54] を使用して分類学的に割り当てられました (2022 年 3 月 1 日現在)。 Kraken2 は、データベース内の一致するゲノムの最下位共通祖先 (LCA) を使用して各シーケンシングリードに分類学的識別子を割り当てる kmer ベースのショートリード分類システムであり、メタゲノムリードの高精度分類に使用されています [56、57]。 Kraken2 レポート ファイルは、Kraken (Bracken) (v2.6.2) [58] を使用して存在量のベイジアン再推定を実行するための入力として使用され、すべてのサンプルの各分類ランクで存在量を再推定しました。 Bracken は、Kraken によって割り当てられた分類ラベルを使用して、各種の存在量を推定します。 その後、ワラビのデータベースは、最も短いリード長を持つサンプルの平均リード長に基づいて、デフォルトの 35 k-mer 長と 100 bp リード長を使用して Kraken2 データベースを使用して構築され、ワラビの微生物群集の相対存在量を再推定しました。種レベル。 Bracken からの出力は、ダウンストリーム分析のために、combine_bracken_outputs.py 関数を使用して結合されました。 kraken-biom ツール (https://github.com/smdabdoub/kraken-biom) は、R での多様性分析のために Bracken からの出力を BIOM 形式のテーブルに変換するために使用されました [59]。

各分類群の相対存在量に加えて、さまざまな細菌分類群の相対存在量と各サンプルから回収された総 DNA に基づいて絶対存在量の推定値を計算しました。 新鮮なサンプル 1 mg あたりの総 DNA (ng) として表される微生物叢密度がサンプルごとに計算され、これを使用して、サンプル 1 mg あたりの DNA ng に相対存在量を乗じて定義されるさまざまな微生物分類群の絶対存在量を計算しました [60] ]。

サンプル中の真核生物の分類学的組成と多様性には、EukDetect (v1.3) [61] を使用してアクセスしました。 EukDetect は、メタゲノムリードを、真菌、原生生物、非脊椎動物後生動物、および非連鎖糸体古細菌のゲノムおよびトランスクリプトームから厳選された保存された遺伝子ファミリーのユニバーサルマーカー遺伝子に合わせて整列させ、その後、低品質の重複リードをフィルタリングします。 最終的な真核生物の存在量は、リードが 4 つ未満の分類群をフィルタリングし、マーカー遺伝子が 2 つ未満にアラインメントすることによって計算されます。 得られた絶対存在量 (シーケンスのキロベースあたりの読み取り数) を使用して、サンプル全体の多様性を比較しました。 RPKS 値は、ライブラリ サイズの中央値をサンプル ライブラリ サイズで割ることによって計算されたスケーリング係数を乗算することによって正規化され、その後、サンプル間での比較に使用されました。

X.perforans の存在量に対する品種と環境の影響を決定するために、Xanthomonas の植物内個体群を追跡するために文化に依存した方法が使用されました。 植物 (各品種/チャンバーから 6 株) を前述のように浸漬接種し、周囲の酸素濃度を高めたチャンバー内に保管しました。 植物内の細菌数を決定するために、接種後 0、7、および 14 日目に葉のサンプルを採取しました。 各サンプリング時間で、滅菌コルク穿孔機を使用して約 4 cm2 の葉面積を採取し、微量遠心管内の滅菌 Dremel® を使用して 1 ml の滅菌 0.01 M MgSO4 緩衝液で浸軟化しました。 次いで、均質化した懸濁液を１０倍に希釈し、続いてスパイラルプレーター（Ｎｅｕ－ｔｅｃＧｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州）を使用して栄養寒天プレート上にプレーティングした。 次に、プレートを 28 °C で 3 日間インキュベートし、細菌数を葉面積 1 平方センチメートルあたりのコロニー形成単位として決定しました。

すべての統計分析と多様性分析は、R (v4.1.3) [59] および Rstudio [62] と Phyloseq (v1.38.0) [63]、vegan (v2.5–7) [64]、および ggplot2 (v3) を使用して実行されました。 .3.5) [65] パッケージ。 データ分析の前に、ライブラリ サイズは、SRS R パッケージ (v0.2.2) [66] の「SRS」機能を使用したランク付けされたサブサンプリングによるスケーリングを使用して正規化されました。 アルファ多様性尺度 Chao1 とシャノン指数は、コミュニティの豊かさと多様性をそれぞれ識別するために使用されました。 ウィルコクソン順位和検定では、ノンパラメトリック データのアルファ ダイバーシティ インデックスの有意差を検定し、正規分布データの T 検定を検定しました。 これらの方法の適切性は、Shapiro-Wilk の正規性検定に基づいて残差の正規分布をチェックすることで検証されました。

品種間および異なる環境条件 (β 多様性) 間の全体的な微生物プロファイルの違いは、Bray-Curtis 距離を使用して推定されました。 微生物群集構造に寄与する要因を理解するために、adonis2 (距離行列を使用した分散分析、ADONIS) で実装されている順列多変量分散分析 (PERMANOVA) [67] を、引数 'by' を 'margins' に設定して実行しました。ビーガン R パッケージ (v 2.5 ～ 7) の Bray-Curtis 非類似性を使用した 1000 個の順列 (p = 0.05) による類似性分析 (ANOSIM)。 さらに、グループ分散の多変量均一性検定 (BETADISPER) [68] を実行して、微生物分類群に関連した因子間の均一な分散を決定しました。 サンプル グループ間の非計量多次元尺度法 (NMDS) は、Bray-Curtis の相違度を使用して計算され、R の ggplot2 パッケージを使用して視覚化されました。

私たちのネットワーク分析では、すべてのサンプルが多様性の大部分を回復するのに十分な配列深度を持っていることを保証するために、分類学的データはサンプルの 20% 以上で少なくとも 0.5% の相対存在量 (有病率) にサブセット化されました。 相関ネットワーク分析は、R パッケージ NetCoMi (v1.1.0) [70] に実装されている SPRING [69] アプローチを使用して実行されました。 治療全体にわたる群集構造は、「cluster_fast_greedy」アルゴリズム [71] を使用して推定され、ハブ分類群は 0.95 の閾値を使用して決定されました。 Jaccard インデックスを使用して、選択したローカル ネットワーク中心性の尺度 (次数、中間中心性、近さ中心性、および固有ベクトル中心性) の類似性 (Jacc = 0、最低の類似性および Jacc = 1、最高の類似性) をテストし、ハブまたはキーストーン分類群を決定しました。 。 定量的ネットワーク評価は、複数のテストに対する適応型 Benjamini-Hochberg 補正を備えた順列アプローチ (1000 ブートストラップ) で実行されました。

微生物群集の機能プロファイリングは、遺伝子存在量 (UniRef90 遺伝子ファミリー) [73] および MetaCyc 経路 [74] を定量化するために、HUMAnN3 (v3.0) [72] と連結したペアエンド配列に対して実施されました。 ChocoPhlAn ヌクレオチド データベース v30 は、機能的経路の存在量とカバレッジの推定に使用されました。 遺伝子ファミリーと経路存在量の表は、シーケンシングの深さが異なるサンプル間の比較を容易にするために、100 万リードあたりのコピー数 (CPM) に合計正規化されました。 その後、HUM​​AnN3 からの出力は QIIME2 (v2021.11) [75] にインポートされ、Bray-Curtis の異種行列を使用して非計量多次元尺度法 (NMDS) 順序が生成されました。 機能プロファイルを駆動する要因を理解するために、adonis2 で実装されている順列多変量分散分析 (PERMANOVA) [67] (距離行列を使用した分散分析、ADONIS) と 1000 個の順列による類似性分析 (ANOSIM) を実行しました (p = 0.05)。 ）上記のように、さまざまな要因（品種、環境、接種状況、サンプリング時間）を伴います。 LEfSe (線形判別分析効果サイズ) (v1.1.2) を使用して、治療全体にわたって差次的に豊富な経路が特定されました [76]。 補正された p 値が 0.05 以下で、線形判別分析 (LDA) スコアが log >2.5 である経路は、2 つのグループのうちの 1 つで有意に増加したものとして分類されました。

耐性品種と比較して、感受性品種では全体的により高い病気重症度指数が記録されました。 周囲条件下では、この感受性品種はシーズン中期に平均 53.01% の病気重症度指数をサポートしましたが、成長期の終わりまでに 15.11% に低下しました。 この耐性品種は、シーズン中期の発病指数が 0.37%、シーズンの終わりまでに 0.29% で、最小限の発病をサポートしました。 O3 の上昇は、感受性のある品種の病気の重症度には影響しませんでした。 しかし、O3上昇条件下の抵抗性品種では、シーズン中期（12.61%）（p < 0.001）とシーズン終了時（2.01%）（p = 0.01）の両方で、環境条件と比較して、著しく高い病害重症度指数が観察されました。環境（シーズン半ば = 0.37%、シーズン終了 = 0.29%）（図 1、表 S1）。

ボックスアンドウィスカープロットは、感受性品種と抵抗性品種にわたる、高いO3および周囲環境条件下での病気の重症度指数（％値で表示）を示しています。 各治療組み合わせの有意水準は *p < 0.05 で示されます。 **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。

実験の初めに収集されたサンプル (ベース サンプル) と生育期の 2 回 (シーズンの半ばとシーズンの終わり) にショットガン メタゲノム シーケンスが行われ、サンプルあたり 2.83 ～ 17.16 Gbps の生の読み取りが生成されました。 アダプターのトリミングと低品質リードの削除により、異なるサンプル間で合計リードの 4.3 ～ 11.3% が失われます。 高品質のトリミングされたリードのうち、5.78 ～ 39.09% のリードがホストリードとして識別され、さらなる分析から除外されました。 苗の初期段階のサンプルでは、​​宿主汚染が高かったため（23 ～ 39%）、フィルタリング時に読み取り値がほとんど得られませんでした。これは、移植前の温室栽培苗における微生物の定着が最小限であることを示しています。 元の合計リードの約 50.61% ～ 84.56% が下流分析のために保持されました (表 S2)。

次に、全体的な微生物の多様性と葉圏群集の豊かさに対する接種とO3の増加の影響、およびそれらの相互作用を調査しました。 季節の半ばと終わりの両方のサンプルにおける全体的な細菌の豊富さと多様性の値は、基本サンプルと比較した場合、対照植物の方が高かった。 これは、温室栽培のベースサンプルでは微生物の定着レベルが低く、自然のフィールド条件にさらされると多様性と豊富さが増加したことに起因すると考えられます。 ベースサンプルの真核生物の多様性は、これらのサンプルのリード数が、サンプル中に存在するとみなされる閾値（2 つ未満のマーカー遺伝子にアラインメントするリード数が 4 つ未満）を下回っていたため、計算されませんでした。 O3 ストレス単独では、両方の品種において細菌 (表 S3) および真核生物の豊富さと多様性 (表 S4) に影響を与えませんでした。 しかし、病原体感染により、細菌の豊富さ（p < 0.001）（図 2A）と多様性（クラスカル-ウォリス、p = 0.01）（図 2B）が大幅に低下し、真核生物の豊富さ（クラスカル-ウォリス、p = 0.01）も低下しました。 ）（図2C）および多様性（Kruskal-Wallis、p = 0.02）（図2D）を、対照植物と比較した、成長期全体の周囲条件下での感受性品種の。 病原菌と酸素濃度の上昇による複合ストレス下では、感受性のある品種ではシーズンの終わりにのみ、豊かさ (p = 0.01) と多様性 (p = 0.04) の両方に有意な影響が見られました。 接種と O3 の上昇は、細菌の豊富さ (pinoc = 0.81、penv = 0.07) (図 2A) および多様性 (pinoc = 0.27、penv = 0.62) (図 2B)、または真核生物の豊富さ (Kruskal-Wallis、pinoc =耐性品種の多様性（Kruskal-Wallis、pinoc = 0.23、penv = 0.82）（図 2D）。 サンプリングの時間は、両方の品種において細菌の豊富さと多様性に重大な影響を及ぼしました (p < 0.01)。

しかし、感受性のある品種に病原体が感染すると、微生物群集の豊かさと多様性が減少します。 A は細菌の Chao1 の豊富さ、B はさまざまな環境における細菌のシャノン多様性指数です。 C 真核生物コミュニティの多様性と D さまざまな治療にわたる豊富さ。 接種サンプルと対照サンプルは上部の黄色と緑色のバーで示され、周囲環境および高酸素処理は下部の水色と赤色のバーでそれぞれ示されます。

2 つのトウガラシ品種と 2 つの環境条件からのサンプル間の細菌群集と真核生物の群集構造の違いを視覚化するために、分類学的存在量プロファイルを使用して Bray-Curtis 距離行列を計算し、ノンメトリック多次元尺度法 (NMDS) を使用して 2 次元にプロットしました。 葉圏微生物群集構造全体に対する各因子の相対的な影響とそれらの相互作用を理解するために、品種、サンプリング時期、環境、接種を独立変数として使用して、ブレイとカーティスの非類似性についてPERMANOVAを実行しました。 全体として、品種、サンプリング時間、および接種の相互作用（p = 0.03）に加えて、品種、サンプリング時間、および接種の影響は細菌群集の形成において非常に重要でした（p < 0.001）（表S5A）。対照感受性植物、接種された感受性植物、および対照抵抗性植物からの、接種された感受性植物の比較（図３Ａ）。 さらに、2 つのサンプリング ポイントにわたる個々の要因の影響と相互作用を評価しました。 品種の効果は顕著でしたが、生育期を通じて減少しました (期半ば: R2 = 0.23、p < 0.001; 期の終わり: R2 = 0.06、p = 0.03)。 対照的に、接種の効果は成長期の経過とともに増加しました（季節の半ば：R2 = 0.20、p < 0.001; 季節の終わり：R2 = 0.55、p < 0.001）（表S5B、C）。 品種間の相互作用と細菌群集に対する接種の影響は、時間の経過とともに統計的に有意なままでしたが、その影響は生育期の終わりまでに規模が減少しました（期半ば: R2 = 0.15、p < 0.01; 期の終わり: R2 = 0.05、p = 0.04)。 O3 上昇の影響は最小限であり、生育期の終わりまでには統計的に有意ではなくなりました (期半ば: R2 = 0.05 p = 0.04; 期の終わり: R2 = 0.02、p = 0.15) (表 S5B、 C)。 環境と他の変数との間の相互作用は、成長期を通じて統計的に有意ではありませんでした。 O3 レベルの増加は、感受性品種の細菌群集構造を変化させませんでした。 ただし、ザントモナス属の非存在下では、耐性品種の細菌群集に影響を与えました（R2 = 0.14、p = 0.02）（表S5D）。 O3 が上昇したチャンバー（p = 0.69）または周囲環境（p = 0.85）の間で微生物群集に差はなく、全体的な細菌の多様性においてチャンバーの影響がないことを示唆しています（表S5E、F）。

2 つの品種、環境条件、サンプリング時間にわたる細菌群集の多様性を比較する非計量多次元尺度法 (NMDS) の順序付け。 B NMDS の指定は、2 つの品種、環境条件、サンプリング時期にわたる真核生物群集の多様性を比較します。

細菌群集と同様に、真核生物群集の多様性も、環境、品種、サンプリング時間、および接種によって顕著な影響を受けました（p < 0.01）（表S6A、B）。 品種は真核生物の多様性に重大な影響を及ぼし、シーズンの終わりにより大きな影響を及ぼしました（シーズン半ば：R2 = 0.12（表S6C）、p = 0.007;シーズンの終わり：R2 = 0.37、p = 0.001（表S6D、 E))。 O3 レベルの増加はシーズン半ばには真核生物群集に大きな影響を与えましたが、シーズンの終わりには有意ではありませんでした（シーズン半ば: R2 = 0.22、p = 0.001 (表 S6C); シーズンの終わり: R2 = 0.06、p = 0.19 (表S6D、E).真核生物群集に対する接種の効果は、シーズン半ばには高く、シーズンの終わりには減少しました(図3B)(シーズン半ば: R2 = 0.15 、 p = 0.003 (表 S6C); シーズンの終わり: R2 = 0.11 p = 0.03 (表 S6D、E)). クラスター化に対するサンプリング時間の影響は、細菌と真核生物の両方のコミュニティの形成において明らかでした (図 3A、 B)。

これらの発見は、抵抗性品種と感受性品種の微生物群集が、病原菌または酸素濃度の上昇のいずれかのストレスがない場合には類似しており、季節継承の影響が細菌群集と真核生物群集の両方に明らかであることを示しています。 病原体感染により、生育期が進むにつれて感受性のある品種の細菌群集の構成が変化しました。 しかし、耐性品種にザントモナス菌集団が存在するにもかかわらず、微生物群集の構造は、接種されていない植物で観察されるものと同様でした。 O3 上昇下では耐性品種の病気の重症度が増加したにもかかわらず、細菌および真核生物群集の組成は周囲環境下と同様でした。

感受性品種と抵抗性品種の対照植物にキサントモナスが存在することは、圃場における天然接種材料のレベルが低いことを示唆しました。 しかし、対照植物におけるザントモナスの相対的な存在量は、時間の経過とともに大幅に増加しませんでした（シーズンの終わりまでに <5%）。 接種した感受性品種と耐性品種では、ザントモナスの相対量と絶対量の両方がシーズン半ばからシーズン終わりにかけて増加しました（図S2A、B）。 高酸素条件下では、耐性を接種した植物におけるザントモナスの相対量 (約 33 ～ 87%) および絶対量 (約 13 ～ 37%) に大きな変動があることは注目に値します。 しかし、O3 の上昇の存在は、どちらの品種でもザントモナスの相対量 (クラスカル-ワリス: pECW = 0.12、pX10R = 0.78) または絶対量 (クラスカル-ワリス: pECW = 0.15、pX10R = 0.54) に有意な差を生じませんでした (図S2A、B）。 耐性を接種した植物の高酸素条件下での病気の重症度レベルが周囲環境下での病気の重症度レベルよりも著しく高かったことを考えると、この観察は驚くべきことであった。

Xanthomonas の個体数に対する O3 の上昇と品種の影響をさらに確認するために、接種後 7 日目と 14 日目に培養依存法を使用して決定された X.perforans の植物内個体群を分析しました。 この短期間の実験は生育期全体の結果を反映していない可能性がありますが、Xanthomonas 個体群に対する O3 上昇の影響を評価することができました。 上記の観察と同様に、これらの品種のX.perforans個体群に対する環境（すなわち、周囲対O3の上昇）の有意な影響はありませんでした（pECW = 0.31、pX10R = 0.34）（図S2C）。

高酸素下での耐性品種の病気の重症度の増加は、ザントモナス菌数の変化の結果ではないため、この増加は、周囲環境と比較して高酸素下での耐性品種に関連する全体の微生物密度の大幅な減少に関連しているという仮説を立てました。環境、O3 上昇下で微生物叢からの予防シールドが変化することを指します。 微生物叢密度の推定値は、腸内微生物叢の研究で計算されたものと同様に、サンプル 1 mg あたりの微生物 DNA 含有量に基づいて取得されました [77]。 微生物叢の密度に対して接種は有意な影響を及ぼしましたが（p < 0.001）、品種（p = 0.15）も O3 の上昇（p = 0.19）も微生物叢の密度に対して有意な影響はありませんでした（図 4A）。 高O3下で接種した抵抗性品種のシーズン中期サンプルでは、​​感受性品種と比較して微生物叢密度が有意に低かったが（p = 0.01）、シーズン終了後のサンプルではそうではなかった（p = 0.13）（表S7A〜D）。 さらに、相対存在量 (図 4B) にサンプル 1 mg あたりの総 DNA を乗じることにより、各細菌属の絶対存在量を推定しました。 微生物叢の全体的な絶対量は、両方の環境下で、接種された感受性品種と比較して、接種された耐性品種の方が低かったが、この差は統計的に有意ではなく、サンプル間の大きな変動の原因となった（図4C、表S7E、F）。 周囲環境下で接種された耐性品種に関連する微生物叢の絶対量の合計は、酸素濃度が高い環境下と比較して有意な差はありませんでした。

2 つの品種のさまざまな処理に対する微生物 DNA 定量化によって推定された微生物叢密度 (葉サンプル 1 mg あたりの抽出 DNA の濃度) を示す箱ひげ図。 B サンプル全体にわたる上位 15 の細菌分類群の相対種 (左) および絶対種 (右) の存在量。 絶対存在量は、相対存在量測定値を微生物叢密度測定値によってスケールすることによって得られます。 C サンプル全体にわたる上位 15 の真核生物属の相対存在量を示す棒グラフ。 接種サンプルと対照サンプルは上部の黄色と緑色のバーで示され、周囲環境および高酸素処理は下部の水色と赤色のバーでそれぞれ示されます。 サンプリングの時間は、Base (最初のサンプル)、Mid (シーズン半ば)、および End (シーズンの終わり) で示されます。

次に、葉圏における群集の集合と継承の時間的動態を調査し、接種植物と対照植物の間でパターンを比較しました。 さまざまな治療法にわたる細菌と真核生物の詳細な分類学的説明は補足情報に記載されています。 分類学的多様性分析により、いくつかの細菌属（図4B、表S8）および真核生物の属（図4C、表S9）が葉圏環境を独占していることが示されました。 これらの微生物属は、病原体の存在、環境ストレス、およびそれらの相互作用によって異なる影響を受けます。

次に、品種または O3 の上昇に応じて相対存在量の変化を示す属を特定しました。 感受性のある品種では、細菌属のシュードモナス属、パントエア属、メチロバクテリウム属、スフィンゴモナス属、メチロブラム属などがマイナスの影響を受けましたが、ミクロバクテリウム属はザントモナス属の存在下でプラスの影響を受けました（図S3A-F）。 感受性品種とは対照的に、耐性品種ではザントモナス属の存在下でシュードモナス属とスフィンゴモナス属の相対的な存在量が増加しました。 細菌属メチロバクテリウムはO3の上昇によりマイナスの影響を受けましたが、シュードモナス属とスフィンゴモナス属は耐性品種においてプラスの影響を受けました（図S3G-L）。 真核生物に関しては、ブレラ属はO3の上昇によりプラスの影響を受けましたが、エピコッカム属とプロトミセス属は処理に関係なく時間的変動がありました（図4C）。

微生物の組成は品種、接種、および時間によって大きく影響されるため、観察された分類学的差異がニッチ特異的な微生物の機能を反映しているかどうかを調査しようとしました。 代謝経路（図5A）の相対存在量に基づく全体的なコミュニティ機能と、経路上にマッピングされた関連遺伝子ファミリー（図5B）は、これらの個々の要因の影響を受けませんでした（p > 0.05）（表S10A、B） ）。 ただし、両方の遺伝子ファミリーと関連経路の機能的組成の相違によって示されるように、接種、品種、サンプリング時間の間の相互作用は、微生物の機能と遺伝子ファミリーに重大な影響を及ぼしました（p < 0.01）（表S10A、B）。接種した耐性品種と比較して、接種した感受性品種から回復した群落の数。 シーズンの終わりに品種の有意な効果が観察されました（p = 0.01）（表S10C）。 O3 の上昇は、耐性品種でも感受性品種でも、また接種状態に関係なく、葉圏微生物叢の機能的集合体を変化させませんでした。 季節の半ばと終わりのサンプルにおける種組成の違いにもかかわらず、それぞれの品種の生育期中の各時点で、遺伝子と経路の両方の点で同様の機能プロファイルが観察されました。 これは、葉圏における分類群の季節的遷移にもかかわらず、成長期を通じて微生物群集に関連する代謝経路の実質的な機能的冗長性によるものと考えられます。

非計量多次元尺度法 (NMDS) の順序付けは、感受性品種と抵抗性品種のさまざまな処理条件にわたる A 代謝経路の多様性を示し、B 遺伝子は感受性品種と抵抗性品種のさまざまな処理条件にわたる代謝経路にマッピングされます。

病原体感染、O3の上昇、およびそれらの相互作用に応じた治療間の違いを説明する、差次的に豊富な経路を見つけるために、線形判別分析効果サイズ（LEfSe）を実行しました。 病原体感染と酸素濃度の上昇により、ヘム消去（生体利用可能な鉄源）に関連する代謝経路が耐性品種から回収された微生物群集に豊富に含まれる一方、炭水化物代謝（ペントースリン酸経路、ガレート分解、グリオキシル酸回路）、保護（脂質）に関連する経路が豊富でした。 IVA生合成）、成長と維持（ホスファチジルグリセロール生合成、CDP-ジアシルグリセロール生合成、GDP-マンノース生合成）、および不飽和脂肪酸の代謝（ゴンド酸生合成）は、周囲条件下で耐性品種から回収された微生物群集で豊富でした（図S4A）。 ）。 O3 ストレス時に両方の品種に関連する微生物群集で富化された代謝経路には、一次エネルギー生産と不飽和脂肪酸 (ベータ酸化、ペントースリン酸) の分解に関与する経路、酸素ストレスに対するさまざまな防御関連経路、および DNA 修復が含まれていました。 （ユビキノール 7、ピリミジン（デオキシ）ヌクレオチド）および酸素非依存性呼吸に関連する経路（酸素非依存性ヘム b 生合成）（図 S4B）。 病原体と上昇したO3の両方の存在下では、プリンヌクレオチドの生成と分解に関連する経路が濃縮されました（図S4C）。

病原体感染と O3 ストレスが単独または組み合わせて葉圏における全体的な微生物の関連に影響を与えるかどうかを評価するために、処理全体にわたる細菌の共起ネットワークとそのトポロジー的特徴を比較しました。 我々は、O3上昇（図6A）、接種（図6B）、およびO3上昇と病原体の複合ストレス下での細菌共起ネットワークのハブ分類群を決定するために使用される次数、中間性、近さおよび固有ベクトル中心性を使用して、ローカルネットワーク中心性の尺度を評価しました。 (図6C)、それぞれ周囲、制御条件、または制御条件と周囲環境と比較しました。 上記のすべての処理比較では、すべてのローカル ネットワーク中心性の尺度について有意な差が示されたことが観察されました (表 S11A)。 ハブ分類群は高度に接続された分類群であり、ネットワーク内で強い影響力を持つことが知られています。 対照と接種サンプル、または対照と病原体およびO3ストレスのある周囲環境を比較すると、治療群間でハブ分類群に有意な差があった(表S11A、B)。 しかし、周囲環境と比較して、高濃度の O3 に曝露された植物のハブ分類群には変化はありませんでした。

さまざまな環境にわたる細菌関連ネットワークの比較。 制御条件下での両方の品種の周囲（上）と高酸素（下）の結合データセットの細菌関連ネットワーク。 B 周囲環境下での両方の品種の対照サンプル (上) と接種サンプル (下) からのデータセットを組み合わせた細菌関連ネットワーク。 C 両方の品種の対照および周囲環境 (上) および接種および増加した O3 サンプル (下) からのデータセットを組み合わせた細菌関連ネットワーク。 ハブ分類群は太字で強調表示されています。 ノードの色は、貪欲なモジュール最適化によって決定されたクラスターを表します。 赤いエッジは負の相関に対応し、緑のエッジは正の相関に対応します。

調整ランド指数 (ARI) に基づいて、周囲ストレスと個別ストレス、または高 O3 と病原体の複合ストレスの間の 2 つのネットワークの全体的な類似性を比較すると、周囲ストレスと高酸素ストレスでは 0 (ARI = 0.02、p = 0.07) に近い値が示されました。 O3ストレス。 対照対接種（ARI = 0.03、p = 0.02）および対照および周囲環境対複合ストレス（ARI = 0.10、p < 0.001）（表S11C）。 これらの観察は、種の群集への分割がこれらの比較において低い程度の類似性を示すことを示しています。 これらの結果は、これらのネットワーク間のトポロジーの違いと、ローカルネットワークの中心性の尺度の相違を伴い、病原体感染とO3ストレスの組み合わせにより、葉圏の細菌群集の相互作用に変化が生じることを示しています。

次に、複雑さ、モジュール性、平均経路長、クラスタリング係数の尺度としてエッジの数などのグローバルな微生物ネットワークの特性を評価し、処理全体のネットワークトポロジーを比較しました[78、79]。 NetCoMi の現在のバージョンでは、単一ネットワーク構築の実行時間が長いため、1000 個の順列しか実行できません。 1000 個の順列で可能な最小の p 値は 1/1000 であるため、検出力は非常に低く、複数のテスト用に調整すると大きな p 値が得られます。 順列の数を増やすと、十分な統計的検出力でグローバル ネットワーク プロパティを評価できる可能性があります。 したがって、この研究では、関連する p 値ではなく、比較対象の各パラメーターの絶対的な差に焦点を当てました。 周囲環境下の微生物ネットワークは、上昇したO3と比較して、より高いポジティブエッジパーセンテージ、より高いクラスタリング係数、より低い平均経路長を示しました（表S11D）。 これは、周囲環境ではよりポジティブな相互作用があり、O3 ストレスがコミュニティのメンバー間でそれほど複雑ではないネガティブな関係を促進する可能性があることを示唆しています。 逆に、病原体感染の存在により、エッジの割合がより正になり、経路長が短くなり、モジュール性が高く、クラスタリング係数が高くなりました。これは、病原体感染下ですべてのノードがネットワーク内で高度に相互リンクされ、より複雑で安定したネットワークを形成したことを示唆しています。 (表S11D)。 しかし、病原体感染とO3ストレスの存在下では、より短い経路長とより高いクラスタリング係数を伴う周囲環境および制御条件下でより正の相互作用が見出され、複合ストレスが地域社会のメンバー間でより複雑で安定性の低い関連を生み出す可能性があることを示唆しています（表S11D） ）。

気候の変化と現代の農業慣行により、農業生態系は害虫の脅威が増大しやすくなっており、生物的ストレスと非生物的ストレスの同時発生に植物がどのように適応するかについては予測不可能な状況が残されています。 多くの研究が、変化する気候における植物の回復力に貢献し、病原体に対する植物の免疫を拡張する上で植物関連マイクロバイオームの役割を提案している[24、30、80、81]。 しかし、生物的ストレス因子と非生物的ストレス因子が同時に存在する中で、微生物群集が植物の適応にどのように反応し、また植物の適応に寄与するのかについては、まだ完全には理解できていません。 この研究では、葉圏細菌および真核生物群集の構造、機能、安定性、および感受性と耐性のピーマン品種における全体的な植物病害の転帰に対する、O3 および病原体ストレスの上昇の個別および同時の影響をテストしました。 この研究で使用された耐性トウガラシ品種は、現在知られているすべての細菌斑点ザントモナス種のトウガラシ品種に対して中間レベルの耐性を提供する耐性遺伝子を持っています[82]。 この品種をこの研究計画に含めた私たちの理論的根拠は、新興病原体種や将来の気候を表す酸素濃度の上昇に対応して、現在米国南東部で広く展開されているこの耐性品種の耐久性を理解することでした。

感受性品種では酸素濃度の上昇による病害の重症度レベルに対する明らかな影響は観察されませんでしたが、耐性品種は成長期を通じて酸素濃度の上昇により周囲環境と比較してより高い病気の重症度を示しました（図 1）。 病気の重症度のこの変化は、O3 上昇条件下での抵抗力の低下を示している可能性もあります。 残念ながら、この研究で使用された品種の選択はほぼ同質遺伝子的ではないため、以前の研究で行われたように、マイクロバイオームに対する耐性遺伝子座の影響を評価することができません[83]。 しかし、酸素濃度上昇下で耐性品種で観察された病気の重症度の増加は、絶対存在量データによって推定されるように、周囲環境と比較した場合のザントモナス属個体数の増加とは関連していませんでした。 このような培養非依存性の DNA 配列決定法は、生きている病原体細胞数を正確に示していない可能性があり、培養依存性の病原体個体数推定値または定量 PCR (qPCR) [84、85]、デジタル ドロップレット PCR などの方法でこれらの所見を確認する必要がある可能性があります。 [86、87]。 成長期全体ではありませんが、2週間の短期実験でザントモナス属の個体群の動態をモニタリングしました。その結果は、抵抗性品種のO3上昇下で病害の重篤度が高まったにもかかわらず、ザントモナス属の個体群は影響を受けなかったという以前の発見を裏付けました。 興味深いことに、O3 上昇下での耐性品種における Xanthomonas 個体群数の大きなばらつきは注目に値します。 これは、変化した環境下で耐性品種に適応する際の病原体の可塑的反応を示している可能性があります。

膨大な研究により、気候変動が植物と病原体の相互作用の結果に重大な影響を与える可能性があることが示されている[88,89,90]。これは、宿主防御経路の改変や病原体感染の増加を介した宿主環境の変化に起因する可能性がある。変化した環境下での効率、またはマイクロバイオームによってもたらされる拡張免疫の変化。 これら 3 つのもっともらしい説明を以下に概説します。これらは、植物 - 病原体 - マイクロバイオームの相互作用を相乗的に促進する可能性があり、高 O3 条件下での潜在的な抵抗性侵食に関するこの研究の観察を説明するのに役立ちます。

非生物的ストレスと生物的ストレスの組み合わせに対する植物の応答に関する研究では、個別のストレスよりも独特で複雑な応答が示されています [38、91、92、93]。 複合ストレスの影響は、時間、ストレスの程度、植物の遺伝子型、その他の気候または環境要因などのさまざまな要因によって支配されるため、本質的に必ずしも相加的であるわけではありません[94]。 植物は、複雑だが重複する防御シグナル伝達経路を介して生物的および非生物的ストレスに応答する[95、96]。非生物的ストレス時に観察されるアブシジン酸（ABA）経路の誘導は、病原体防御に関与するサリチル酸（SA）経路に拮抗する[97]。 、98]。 病原体感染と酸素濃度の上昇による同時ストレスにより、耐性品種の宿主免疫応答が変化する可能性があります。 [O3]の上昇によって引き起こされる植物のクチクラの酸化損傷は、病原体への曝露を増加させる可能性があり、したがって病気の重症度に影響を与える可能性があります[99]。 この現在の研究を宿主トランスクリプトミクスで補完することで、O3 上昇の存在下での抵抗性品種に対する感受性の増加がそのような宿主防御の変化によって説明される可能性があるかどうかが説明されるでしょう。 第二に、変化した環境下でのエフェクター出力の増加による病原体の毒性の増加[89]は、病原体数の大幅な増加がない場合の疾患の重症度の増加を説明できる可能性があります。 病原体集団の変動の増加は、宿主の可塑性応答または病原体集団の可塑性のいずれかによる可能性があります。

第三に、この研究の観察結果の最も重要な説明は、O3 の上昇と病原体感染に応じた耐性品種のマイクロバイオーム媒介防御の変化です。 以前の研究で実証されているように、葉圏で耐性品種によって動員された微生物群集は病原体に対する保護的な役割を果たしている可能性があり[13、100]、この保護的役割は酸素濃度が上昇すると変化した可能性があり、それが病気の増加につながった可能性がある。重大度。 感受性品種の細菌および真核生物群集の組成、構造および機能は、病原体感染または O3 の上昇がない場合でも差異はありませんでした。 しかし、耐性品種の細菌群集構造は、病原体が存在しない場合でも、O3 の上昇の存在によって影響を受けました。 我々が調査した品種は耐性遺伝子座に関して同質遺伝子に近い系統ではなかったため、微生物群集構造に対するこのような異なる影響が特定の耐性遺伝子座によるものであるかどうかはまだ解明されていない。 感受性のある品種では、同時に発生する O3 ストレスがマイクロバイオームの構造と機能をさらに変化させなかったにもかかわらず、病原体感染の存在により細菌群集の構造と機能に大きな変化が生じました。 感染時の耐性品種ではマイクロバイオームの構造と機能に大きな変化は観察されませんでしたが、感染した耐性品種に関連する全体的な微生物叢密度は、感染した感受性品種と比較して低かったです。 さらに、同時に発生する O3 ストレスにより、感染した耐性品種のシーズン中期のサンプリング中に微生物叢の総密度が低下しました。 このような減少が、酸素濃度の上昇と病原体感染の複合的な影響下で耐性品種に関連するマイクロバイオームの予防能力の低下を反映しているかどうかは、まだ調査されていない。 病原体に対するマイクロバイオームを介した防御を評価するさらなる実験は、以前の研究と同様に、耐性品種に関連する合成コミュニティを使用して設計できます[101]。 これらの実験は、環境の変化が群集の個々のメンバーの絶対数とその相互作用、および関連する機能的特性に及ぼす影響を分析する機会を提供する可能性があります。 興味深いことに、我々のデータは、耐性品種に関連する微生物群集の機能に対する同時ストレス要因の影響を明らかにしませんでした。 以前の研究が非生物的または生物的ストレス要因下で特定の代謝経路の強化を示していることを考えると、これは驚くべきことであった[102、103、104]。

生態系における微生物の機能は、分類群の数と構成だけでなく、コミュニティのメンバー間のさまざまな肯定的、否定的、直接的、間接的な関連によっても決定されます[105]。 病原体の攻撃に応じて、高密度に接続されたネットワークを示すネットワーク パラメーターが観察されました。 病原体感染時の微生物群集間の積極的かつ複雑な関連性の強化に関するこれらの所見は、葉圏と内層圏の両方で観察されている[106、107、108]。 このような密に接続されたネットワークは、促進、相利共生または共利主義、および相互給餌などの協力的な関係を示しています [79, 109]。 このような接続されたネットワークは、スモールワールド ネットワーク [110] と呼ばれ、妨害に対する抵抗力を秘めていると仮説が立てられています。 対照的に、O3 ストレスおよび病原体と O3 ストレスの同時にわたる微生物の共起ネットワークは、対照環境と比較して比較的不安定なランダム ネットワークの同様の傾向を示しました。 この発見は、さまざまな程度の環境ストレスが微生物群集の安定性を乱すという考えと一致している[79]。 最も中心にあるノードの類似性からの観察は、微生物群集が処理が異なるとかなり異なることを示唆しています。 病原体の存在、および同時に病原体と O3 ストレスがハブ分類群に大きな影響を与えました。 しかし、個別のストレスではなく同時ストレス要因は、最も影響力のある分類群に大きな影響を及ぼし、植物がランダムネットワーク内で最も影響力のある微生物メンバーを変更することによって同時ストレスに応答することを示唆しています。 群落構成に対する強い品種の影響が観察されたため、個々の品種の影響、ひいては微生物群集ネットワークに対する宿主防御応答の影響をさらに詳しく分析することは興味深いでしょう。 しかし、本研究ではサンプルサイズが限られているため、個々の品種間のネットワーク構造を比較するのに十分な検出力がありません。 O3 の上昇は細菌群集よりも真核生物群集に強く影響し、病原体感染は細菌群集に影響を与えることが観察されたため、この場合、王国を越えた相互作用への影響を除外することはできません。 それにもかかわらず、ショットガンメタゲノムデータを使用して真核生物群集の相対存在量を評価するための適切な方法が存在しないため、本研究では、特定の同時ストレス要因が王国を越えた相互作用にどのように影響するかを決定する際に限界があります。 他の非生物的ストレス要因で示されているように、O3 の上昇が界を越えた相互作用に影響を与える可能性があります [30]。

全体として、私たちの研究は、微生物群集が群集構成だけでなく、メンバー間の相互作用や群集全体の機能を変えることによって変化に反応することを実証しました。 この研究は、気候の変化に応じた微生物群集の複雑な反応と宿主遺伝子型との相互作用を理解するための基礎を提供します。 植物は葉圏マイクロバイオームのメンバーと関連して進化してきたため、この研究で特定された群落のメンバーは、非生物的ストレスまたは複合ストレスに応じた変化の影響を特に受けやすいことが示されています。 この研究の結果は、ストレス耐性植物のためにマイクロバイオームを利用するという将来の研究を評価する上で極めて重要です。

この研究から生成された配列データは、BioProject アクセッション PRJNA889178 として SRA (Sequencing Read Achieve) データベースに保管されています。 この研究で使用された他のすべてのデータとコードは、次の GitHub リポジトリ (https://github.com/Potnislab/AtDep_2021_metagenome) で入手できます。

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温室内での植物の維持と実験全体を通しての支援をしてくださったオーストン・ホランドに感謝します。 最初の植栽に協力してくれた Potnis、Leisner、Sanz-Saez 研究室のメンバーに感謝します。 OTC と燻蒸の設定と維持を行ってくださった Seth Johnston に感謝します。 この作業を行うために必要な計算リソースを提供してくださった David Young 博士とアラバマ スーパーコンピュータ庁のスタッフに感謝します。

この研究は、アラバマ農業試験場と米国農務省国立食糧農業研究所の孵化プログラム (プロジェクト # 10108601) によって支援されました。

オーバーン大学昆虫学および植物病理学部門、オーバーン、アラバマ州、36849、米国

リシ・バンダリ & ネーハ・ポトニス

オーバーン大学作物・土壌・環境科学部、オーバーン、アラバマ州、36849、米国

アルバロ・サンス＝サエス

オーバーン大学生物科学部、オーバーン、アラバマ州、36849、米国

コートニー・P・ライスナー

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NP、ASS、および CPL が研究を概念化し、設計しました。 RBは実験計画に貢献し、サンプル収集とサンプル処理を実施しました。 RB と NP はデータを分析し、すべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

ネーハ・ポトニスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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受信日: 2022 年 10 月 25 日

改訂日: 2023 年 3 月 8 日

受理日: 2023 年 3 月 15 日

公開日: 2023 年 3 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00232-w

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