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誘電体バリア放電プラズマリアクターで生成したオゾンの多剤に対する有効性

May 26, 2023May 26, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 14118 (2022) この記事を引用

1019 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

汚染された医療環境は、多剤耐性菌 (MDRO) やクロストリディオイデス ディフィシルの蔓延に重要な役割を果たしています。 この研究は、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム(VRE)、カルバペネム耐性肺炎桿菌(CRE)、カルバペネム耐性シュードモナス属によって汚染されたさまざまな材料に対する、誘電体バリア放電(DBD)プラズマリアクターによって生成されたオゾンの抗菌効果を評価することを目的としました。緑膿菌(CRPA)、カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマンニ(CRAB)およびクロストリジウム・ディフィシル胞子。 VRE、CRE、CRPA、CRAB、C. ディフィシルの胞子によって汚染されたさまざまな材料を、異なるオゾン濃度と曝露時間で処理しました。 原子間力顕微鏡 (AFM) は、オゾン処理後の細菌表面の修飾を実証しました。 500 ppm のオゾン量を 15 分間 VRE と CRAB に適用した場合、ステンレス鋼、布地、木材では約 2 log10 以上の減少が観察され、ガラスとプラスチックでは 1 ~ 2 log10 の減少が観察されました。 C. ディフィシルの胞子は、試験した他のすべての微生物よりもオゾンに対して耐性がありました。 AFM では、オゾン処理後の細菌細胞が膨張し、歪んでいました。 DBD プラズマ リアクターによって生成されたオゾンは、医療関連感染症の一般的な病原体として知られる MDRO およびクロストリジウム ディフィシル胞子に対して、シンプルで価値のある除染ツールを提供しました。

多剤耐性菌 (MDRO) の出現は、人間や動物における抗生物質の誤用が原因であり、世界保健機関 (WHO) によって公衆衛生に対する深刻な脅威として定義されています1。 特に医療施設は、MDRO の出現と普及にますます直面しています。 主なMDROは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびバンコマイシン耐性腸球菌(VRE)、拡張スペクトルβラクタマーゼ(ESBL)産生エンテロバクテラル菌、多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニおよびカルバペネム耐性エンテロバクテラル菌(CRE)です。 。 また、クロストリディオイデス ディフィシル感染症は、医療関連の下痢の主な原因であり、医療システムに大きな負担をかけています2。 MDRO と C. ディフィシルは、医療従事者の手、汚染された環境、または人から人へ直接感染します。 最近の研究では、医療従事者 (HCW) が汚染された表面に触れて手を汚染した場合、または患者が汚染された表面に直接接触した場合、汚染された医療環境が MDRO および C. ディフィシルの蔓延に重要な役割を果たしていることが示されています3。 4. したがって、医療施設の汚染された環境を清掃すると、MDRO および C. ディフィシルによる感染または定着率の低下につながります 5、6、7。 抗菌薬耐性の増加に対する世界的な懸念を考慮すると、医療施設の除染技術と手順に関するさらなる研究が必要であることは明らかです。 最近、端子洗浄のためのノータッチ方法、特に紫外線 (UV) 装置や過酸化水素システムが有望な除染方法とみなされています。 しかし、UV または過酸化水素を使用するこれらの市販の装置は高価であるだけでなく、UV 滅菌は露出した表面に対してのみ効果があり、過酸化水素によるプラズマ滅菌は次の滅菌サイクルまで比較的長いパージ時間を必要とします5。

オゾンには既知の消毒特性があり、安価に製造できます8。 これは人間の健康に有毒であることも知られていますが、すぐに酸素に解離されます8。 誘電体バリア放電 (DBD) を備えたプラズマ リアクターは、現在入手可能な最も一般的なオゾン発生装置です9。 DBD デバイスを使用すると、空気中でオゾンを生成しながら低温プラズマを生成できます。 オゾンの実用化はこれまでのところ、主にプールの水、飲料水、廃水の消毒に限定されています10。 医療現場での使用を報告した研究はほとんどありません8,11。

この研究では、コンパクトな DBD プラズマ オゾン発生器を使用して、MDRO と C. ディフィシル、さらには医療現場で一般的に使用されているさまざまな材料に接種されたものを除染する効果を証明しています。 さらに、オゾンによる滅菌プロセスは、オゾン処理した細胞の原子間力顕微鏡 (AFM) イメージングによって解明されました。

細菌株は臨床分離株から調製されました: VRE (SCH 479 および SCH 637)、カルバペネム耐性肺炎桿菌 (CRE; SCH CRE-14 および DKA-1)、カルバペネム耐性緑膿菌 (CRPA; 54 および 83)、およびカルバペネム耐性アシネトバクター バウマニ (CRAB; F2487 および SCH-511)。 クロストリディオイデス ディフィシルは、韓国疾病管理予防庁の国立病原菌培養コレクション (NCCP 11840) から入手しました。 これは2019年に韓国の患者から分離されており、多座位配列タイピングで判定されたところST15に属していた。 VRE、CRE、CRPA、および CRAB を接種したブレインハートインフュージョン (BHI) ブロス (BD、米国メリーランド州スパークス) を完全に混合し、37 °C で 24 時間インキュベートしました。

C.ディフィシルを嫌気的に血液寒天上に48時間画線培養した。 次に、いくつかのコロニーを 5 mL の脳心臓注入ブロスに加え、嫌気的に 48 時間インキュベートしました。 その後、培養物をボルテックスし、5 mLの95%エタノールを加え、再度ボルテックスし、室温で30分間放置した。 3000 × g で 20 分間遠心分離した後、上清を廃棄し、胞子と死滅した細菌を含むペレットを 0.3 mL の水に懸濁しました。 生細胞の計数は、適切に希釈した後、細菌細胞懸濁液を血液寒天プレート上にらせん状にプレーティングすることによって実施した。 グラム染色により、細菌構造の 85% ~ 90% が胞子であることが確認されました 12。

次の研究は、医療関連感染を引き起こすことが知られている MDRO および C. ディフィシル胞子が播種されたさまざまな表面の消毒剤としてのオゾンの効果を調査するために実施されました。 1センチメートル×1センチメートルの大きさのステンレス鋼、布地(綿)、ガラス、プラスチック(アクリル)および木材(松)クーポンを用意した。 クーポンは使用前に滅菌されました。 すべてのクーポンは細菌で汚染される前にオートクレーブ滅菌によって消毒されました。

この研究では、細菌細胞を寒天プレートだけでなくさまざまな基板表面にも分注しました。 次いで、プレートを密閉チャンバー内で一定期間、一定濃度のオゾンに曝露することにより滅菌した。 オゾン殺菌装置の写真を図1に示します。 DBD を備えたプラズマ リアクターは、厚さ 1 mm のアルミナ (誘電体) プレートの表裏に穴のあいた裸のステンレス鋼電極を取り付けることによって作成されます。 穴あき電極の場合、細孔サイズと開口面積はそれぞれ 3 mm と 0.33 でした。 各電極は直径43mmの円形であった。 高電圧高周波電源 (GBS Elektronik GmbH Minipuls 2.2) を使用して、周波数 12.5 kHz でピークツーピーク約 8 kV の正弦波電圧を多孔電極に印加し、プラズマが電極の縁に沿って生成されました。穴あき電極。 この技術はガスによる滅菌方法であるため、滅菌は、細菌で汚染されたサンプルとプラズマ発生器がそれぞれ配置された上部と下部の室に容積で分割されたチャンバー内で実行されました。 上部コンパートメントには、残留オゾンのパージと換気に使用される 2 つのバルブ ポートがありました。 実験に使用する前に、プラズマ装置を点灯した後のチャンバー内のオゾン濃度の時間的変化を水銀灯の253.65nm線の吸収分光法により測定した。

(a) DBD プラズマリアクターから生成されたオゾンを使用してさまざまな材料上の細菌を滅菌するための実験セットアップの概略図、および (b) 滅菌チャンバー内のオゾン濃度とプラズマ生成時間。 グラフは、OriginPro バージョン 9.0 (OriginPro ソフトウェア、米国マサチューセッツ州ノーサンプトン、https://www.originlab.com) を使用してプロットされました。

まず、オゾン濃度と処理時間を変化させながら寒天プレート上に菌体をオゾン滅菌し、MDROとC.ディフィシルを除染するのに適切なオゾン濃度と処理時間を推定した。 滅菌では、まずチャンバーを周囲の空気でパージし、次にプラズマ装置をオンにしてチャンバーをオゾンで満たしました。 サンプルをオゾンで一定時間処理した後、残ったオゾンをダイヤフラムポンプを使用して排気しました。 測定では、完全な 24 時間培養サンプル (約 108 CFU/mL) が使用されました。 細菌細胞懸濁液サンプル (20 μL) を最初に滅菌生理食塩水で 10 倍に連続希釈し、次にこれらのサンプルをチャンバー内でオゾン滅菌した寒天プレート上に分注しました。 その後、曝露したオゾンサンプルと曝露していないオゾンサンプルからなる複製サンプルを 37 °C で 24 時間インキュベートし、滅菌効率を評価するためにコロニーの数をカウントしました。

次に、上記の研究から決定した滅菌条件を用いて、医療施設で頻繁に使用されるさまざまな材料クーポン(ステンレス鋼、布、ガラス、プラスチック、木製クーポン)を使用して、MDRO および C. ディフィシルに対する本技術の除染効果を評価しました。 完全な 24 時間培養 (約 108 CFU/mL) を使用しました。 細菌細胞懸濁液サンプル (20 μL) を滅菌生理食塩水で 10 倍に連続希釈し、次にこれらの希釈したブロスそれぞれにクーポンを浸して汚染を評価しました。 希釈ブロスに浸漬した後に取り出したクーポンを滅菌ペトリ皿に置き、室温で24時間乾燥させた。 ペトリ皿の蓋をクーポンの上に置き、慎重に試験チャンバー内に置きました。 ペトリ皿の蓋を取り外し、クーポンを 500 ppm のオゾンガスに 15 分間曝露しました。 対照クーポンは生物学的安全キャビネット内に覆われたまま放置され、オゾン試験条件にはさらされませんでした。 オゾン曝露の直後、クーポンおよび曝露されていないもの(すなわち対照)を、ボルテックスミキサーを使用して滅菌食塩水と混合し、表面から細菌を剥離した。 溶出した懸濁液を滅菌生理食塩水で 10 倍に連続希釈し、次に希釈した細菌を好気性細菌の場合は血液寒天プレートに、C. ディフィシルの場合はブルセラ嫌気性血液寒天プレートに定量的にプレーティングし、37 °C で 24 時間、または嫌気的に 37 ℃でインキュベートしました。元の接種材料濃度を決定するために、2 回 °C で 48 時間静置します。 曝露されていない対照と曝露されたクーポンの細菌数の差を計算すると、試験条件下での細菌の対数減少 (すなわち、滅菌効率) が得られました。

AFM イメージングでは、生体細胞を平板上に固定する必要があります。 したがって、セルのサイズよりも粗さのスケールが小さい、平らで均一に粗い雲母のディスクがベースプレートとして使用されました。 ディスクの直径と厚さは、それぞれ 20 mm と 0.21 mm でした。 細胞を表面にしっかりと固定するために、雲母表面をポリ-L-リジン (200 μL) でコーティングして、細胞膜が負に帯電しているのと同じように正に帯電させました。 ポリ-L-リジンコーティング後、雲母ディスクを1 mLの脱イオン(DI)水を使用して3回洗浄し、空気中で一晩乾燥させた。 次に、希釈した細菌溶液を分注することによって細菌細胞をポリ-L-リジンでコーティングされた雲母の表面にロードし、30分間放置し、その後1 mLのDI水を使用して雲母表面を洗浄しました。

サンプルの半分にオゾン処理を施し、VRE、CRAB、C. difficile 胞子が付着した雲母プレート表面の形態を AFM (XE-7、パーク システム) で画像化しました。 AFM の動作モードは、生体細胞の画像を撮影する一般的な方法であるタッピング モードに設定されました。 実験には非接触モード用に設計されたマイクロカンチレバー(OMCL-AC160TS、OLYMPUS Microscopy)を使用しました。 AFM 画像は 0.5 Hz のプローブ走査速度に基づいて記録され、画像解像度は 2048 × 2048 ピクセルになりました。

効果的な滅菌のための DBD プラズマリアクターの条件を決定するために、MDRO (VRE、CRE、CRPA、CRAB) と C. difficile を使用してオゾン濃度と曝露時間を変更しながら連続実験を実行しました。 図 1b は、プラズマ装置の電源を入れた後の各試験条件におけるオゾン濃度の時間的追跡を示しています。 濃度は対数的に増加し、1.5 分後と 2.5 分後にそれぞれ 300 ppm と 500 ppm に達することがわかりました。 VRE に関する予備テストでは、細菌を効率的に除染するための最小要件は、10 分間のオゾン量 300 ppm であることが実証されました。 したがって、以下の実験では、MDRO と C. ディフィシルを 2 つの異なるオゾン濃度 (300 および 500 ppm) および 2 つの異なる曝露時間 (10 分および 15 分) に曝露しました。 オゾン線量と曝露時間の各設定について滅菌効率を計算し、表 1 にまとめました。300 または 500 ppm のオゾンに 10 ~ 15 分間曝露すると、全体の VRE が 2 log10 以上減少しました。 CRE に対するこの高レベルの細菌死滅は、300 または 500 ppm のオゾン濃度で 15 分間曝露することで達成されました。 500 ppm のオゾンに 15 分間曝露すると、CRPA の高い減少 (> 7 log10) が達成されました。 300 ppm のオゾンでは、CRAB の細菌死滅は無視できるほどでした。 ただし、500 ppm のオゾンでは、> 1.5 log10 の減少が見られました。 C. ディフィシルの胞子を 300 または 500 ppm のオゾンに曝露すると、log10 が 2.5 以上減少しました。

上記の実験に基づいて、細菌の不活化に対する十分な要件は、15 分間 500 ppm のオゾン量で結論付けられました。 VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子について、病院環境で頻繁に使用されるステンレス鋼、布地、ガラス、プラスチック、木材などのさまざまな材料に対するオゾンの滅菌効果がテストされました。 それらの滅菌効率を表 2 に示します。試験した微生物を 2 回評価しました。 VRE と CRAB では、ステンレス鋼、布地、木材の表面では約 2 log10 以上の減少が観察されましたが、ガラスやプラスチックの表面ではオゾンの防腐効果が劣っていました。 C. ディフィシルの胞子は、試験した他のすべての微生物よりもオゾン処理に対する耐性が高かった。 さまざまな材料を使用して、VRE、CRAB、および C. ディフィシルの細菌死滅に対するオゾンの効果を統計的に調べるために、さまざまな材料の 1 ミリリットルあたりのコロニー形成単位数と治療のコロニー形成単位の差を、t 検定を使用して比較しました (図2)。 すべての菌株で統計的に有意な差が見られましたが、C. ディフィシル胞子よりも VRE および CRAB でより有意な差が観察されました。

さまざまな材料に対する (a) VRE、(b) CRAB、および (c) C. ディフィシルの細菌死滅に対するオゾンの影響の散布図。

オゾン処理および未処理のVRE、CRABおよびC.ディフィシルの胞子に対してAFMイメージングを実行し、ガス状オゾンによる滅菌プロセスを詳細に調査します。 図 3a、c、および e は、それぞれ未処理の VRE、CRAB、および C. ディフィシル胞子の AFM 画像を示しています。 3D 画像が示すように、細胞は滑らかで無傷でした。 図 3b、d、f は、オゾン処理にさらした後の VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子を示しています。 すべてのテストセルでは、全体のサイズが縮小しただけでなく、オゾン暴露後に表面が著しく粗くなりました。

VRE、MRAB、および C. ディフィシレの胞子 (a、c、e) 未処理、および 500 ppm のオゾンで 15 分間処理した (b、d、f) の AFM 画像。 画像は、Park Systems バージョン 5.1.6 の XEI プログラム (XEI ソフトウェア、韓国、水原、https://www.parksystems.com/102-products/park-xe-bio) を使用してプロットされました。

私たちの研究では、DBD プラズマ装置によって生成されたオゾンが、医療関連感染の主な原因として知られる MDRO および C. ディフィシルの胞子を効果的に除染する能力を示したことが示されました。 また、我々の研究では、MDROsやC. difficileの胞子による環境汚染が医療関連感染源となる可能性を考慮し、主に病院施設で使用される資材に対してオゾンによる滅菌効果に成功しました。 ステンレス鋼、布、ガラス、プラスチック、木材などの材料を MDRO および C. ディフィシル胞子で人為的に汚染した後、DBD プラズマ装置を使用して除染テストが実施されました。 その結果、材質により除染効果に差はあるものの、オゾンには大きな除染能力があることが分かりました。

病室にある頻繁に触れる物体には、定期的な低レベルの消毒が必要です。 このような物体の標準的な除染は、第 4 級アンモニウム化合物などの液体消毒剤を使用した手動洗浄です 13。 たとえ推奨される消毒剤の使用を厳守したとしても、MDRO は従来の環境洗浄、通常は手作業による洗浄によって除去するのは困難です 14。 したがって、ノータッチ方式などの新しい技術が望まれています。 その結果、過酸化水素やオゾンなどのガス状消毒剤に関心が集まっています10。 ガス状の消毒剤の利点は、従来の手動の方法ではアクセスできない場所や物体に到達できることです。 過酸化水素は最近医療現場で使用されています。 ただし、過酸化水素自体は有毒であるため、厳密な取り扱い手順に従って取り扱う必要があります。 過酸化水素によるプラズマ滅菌では、次の滅菌サイクルまでに比較的長いパージ時間が必要です。 比較すると、オゾンは、他の消毒剤に耐性のある細菌やウイルスに対して効果的な広域スペクトルの抗菌剤として適用できます8、11、15。 さらに、オゾンは周囲の空気を使って安価に生成でき、最終的には酸素に分解されるため、環境に有害な足跡を残す可能性のある追加の有毒化学物質を必要としません。 それにもかかわらず、オゾンが消毒剤として広く使用されない理由は次のとおりです。 オゾンは人間の健康に有毒であるため、その濃度は 8 時間平均で 0.07 ppm 未満に制限されており 16、主に廃空気の浄化を目的としてオゾン滅菌器が開発され、商品化されています。 除染後にガスを吸入し、不快な臭いが発生する可能性もあります5,8。 オゾンは医療現場ではまだ積極的に使用されていません。 ただし、滅菌チャンバーと適切な換気手順を使用すればオゾンを安全に使用でき、触媒コンバーターを使用するとオゾンの除去を大幅にスピードアップできます。 この研究では、プラズマ オゾン滅菌器が医療現場の滅菌に使用できることを実証しました。 高い滅菌力を持ち、取り扱いが容易で、入院患者の収容に迅速に対応できる装置を開発しました。 また、外気を利用したシンプルな構造でコストのかからない滅菌装置を開発しました。 現在まで、MDRO を不活化するためのオゾンの最小要件に関する十分な情報はありません。 今回使用した装置は構成がシンプルで稼働時間が短いため、頻繁に器具を滅菌する場合に有用であることが期待されます。

オゾンの殺菌作用のメカニズムは完全には理解されていません。 いくつかの研究では、オゾンが細菌の細胞膜を破壊し、細胞内漏出を引き起こし、最終的には細胞溶解を引き起こすことが示唆されています17,18。 オゾンはチオール基と反応して細胞の酵素活性を妨害する可能性があり、核酸のプリン塩基とピリミジン塩基を修飾する可能性があります19。 この研究では、オゾン処理前後の VRE、CRAB、および C. ディフィシルの胞子の形態が視覚化され、サイズが縮小しただけでなく、表面が著しく粗くなっていることが明らかになり、最外膜および内部材料の損傷または腐食が示されました。オゾンガスの強力な酸化力によるものです。 このような損傷は、細胞変化の重症度に応じて細胞の不活性化を引き起こします18。

C. ディフィシルの胞子は、病院環境から除去することが難しいことが知られています。 胞子は、放出された場所に長期残留します10,20。 また、この研究では、オゾンを 500 ppm で 15 分間使用した場合、寒天プレート上のカウントの最大 log10 減少は 2.73 でしたが、C. ディフィシル芽胞に対するさまざまな材料に対するオゾンの滅菌効果は減少しました。 したがって、医療現場における C. ディフィシル汚染を減らすために、さまざまな戦略が検討される可能性があります。 C.ディフィシル隔離室のみでオゾン処理を適用し、曝露時間と強度を調整することも有用かもしれません。 そして、オゾン汚染除去法は、消毒剤を使用した日常的な手動洗浄を完全に置き換えることはできず、抗菌政策も C. ディフィシルの制御に非常に効果的である可能性があることを覚えておく必要があります5。 この研究では、滅菌剤としてのオゾンの有効性は MDRO の種類によって異なりました。 有効性は、成長段階、細胞エンベロープ、修復機構の効率など、いくつかの要因に依存する可能性があります21、22。 各材料の表面におけるオゾン滅菌の有効性が異なる理由は、バイオフィルムの形成に関連している可能性があります。 以前の研究では、A. baumanni と E. faecium がバイオフィルムとして存在する場合、環境耐性が向上することが示されています 23,24,25。 それにもかかわらず、この研究は、オゾンが MDRO および C. ディフィシルの胞子に対して顕著な殺菌効果があることを示しました。

私たちの研究の限界は、再培養後のオゾン消毒効果を評価したことです。 生き残った細菌細胞の数が過大評価される可能性があります。

この研究は病院環境における滅菌器としてのオゾンの有効性を評価するために実施されましたが、私たちの結果をすべての病院環境に一般化することは困難です。 したがって、実際の病院環境におけるこの DBD オゾン滅菌器の適用性と互換性を調べるには、さらなる研究が必要です。

DBD プラズマ リアクターによって生成されたオゾンは、MDRO および C. ディフィシルに対して簡単で価値のある除染ツールを提供できます。 したがって、オゾン処理は病院環境の消毒の有効な代替手段とみなされる可能性があります。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

多剤耐性生物

誘電体バリア放電

バンコマイシン耐性腸球菌

カルバペネム耐性エンテロバクテラル属

カルバペネム耐性緑膿菌

カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマニ

原子間力顕微鏡

世界保健機関

拡張スペクトルβラクタマーゼ

医療従事者

紫外線

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Ch'ng、JH、Chong、KKL、Lam、LN、Wong、JJ & Kline、KA 腸球菌によるバイオフィルム関連感染症。 ナット。 Rev.Microbiol. 17(2)、82–94。 https://doi.org/10.1038/s41579-018-0107-z (2019)。

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この研究は、成均館大学-江北サムスン病院 (SKKU-KSH) の未来融合研究プログラム助成金によって支援されました。

成均館大学機械工学部、2066、京畿道水原市長安区セルブ路

ボン・チョルウ、ペ・ジンスン、パク・ソンス、バク・ムンス

SKKU 統合生物医学研究所 (BICS)、成均館大学、水原、韓国

ソンス・パク&ムン・スバク

成均館大学医学部微生物学科(水原、韓国)

チェ・ジヨン&グァンスコ

成均館大学医学部カンブクサムスン病院内科感染症科、29、Saemoonan-ro、Jongro-gu、Seoul、03181、Republic of Korea

ヘ・ソクチョン

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MSB、KSK、および HSC は、研究の構想と設計、分析、原稿の作成に関与します。 実験に参加したCB、JYC、JB、SP。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ムン・スバクまたはヘ・ソクチョンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Bong, C.、Choi, JY、Bae, J. 他誘電体バリア放電プラズマリアクターによって生成されたオゾンの、多剤耐性病原体およびクロストリディオイデス・ディフィシル芽胞に対する有効性。 Sci Rep 12、14118 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-18428-w

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受信日: 2022 年 3 月 18 日

受理日: 2022 年 8 月 11 日

公開日: 2022 年 8 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18428-w

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